母性および/またはポスト - インシュレーションスーツ株式会社

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8900 (2023) この記事を引用

97 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

この研究では、母豚および/または離乳後のバチルス・アルティトゥディニスの補給が、雌豚の初乳と糞便、および子の消化器と糞便中の微生物叢に及ぼす影響を調べました。雌豚 (n = 12/グループ) を、妊娠 100 日目から離乳 (授乳開始 26 日目) まで、(1) 標準食餌 (CON)、または (2) プロバイオティクス B. アルティトゥディニス胞子を添加した CON (PRO) に割り当てました。）。離乳時に、子孫は 28 日間 CON または PRO に割り当てられ、その結果、(1) CON/CON、(2) CON/PRO、(3) PRO/CON、および (4) PRO/PRO となり、その後すべてが CON を受け取りました。。 16S rRNA 遺伝子配列決定のために、雌豚および選択された子孫 (n = 10/グループ) からサンプルを収集しました。 PRO 雌豚の初乳には Rothia がより豊富に含まれていました。雌豚の糞便には影響はありませんでしたが、子の糞便と消化物では違いが確認されました。ほとんどは、離乳後 8 日目の PRO/CON と CON/CON の間の回腸消化管にありました。すなわち、Bacteroidota、Alloprevotella、Prevotella、Prevotellaceae、Turicibacter、Catenibacterium、Blautia は PRO/CON でより豊富で、Firmicutes と Blautia は CON/CON と比較して PRO/PRO でより豊富でした。乳酸桿菌は、離乳後 118 日目の PRO/CON の糞便中により豊富に存在していました。この多糖類発酵菌（プレボテラ、アロプレボテラ、プレボテラ科）、酪酸生成菌（ブラウティア）、および乳酸菌の存在量の増加は、以前に報告された増殖性能の改善に寄与した可能性があります。全体として、離乳後ではなく母親のプロバイオティクスの補給が腸内細菌叢に最も大きな影響を与えました。

商業的な養豚生産において、離乳期は豚の成長と健康に悪影響を与える困難な時期です1。この期間中、子豚は心理的、環境的、栄養的ストレス要因 2,3 にさらされ、その結果、離乳後下痢 (PWD) に対する感受性が高まり、成長能力が低下することがよくあります 2。これらの問題を防ぐために、抗生物質と酸化亜鉛 (ZnO) が離乳した豚の飼料に頻繁に添加されます。しかし、EU では、抗菌薬耐性の増加により、成長促進を目的とした抗生物質の使用が 2006 年に禁止されました (EC 規則 no. 1831/2003)。動物の集団内および薬用飼料を介した抗生物質の予防的使用の禁止、および薬理学的用量の ZnO の使用の禁止を含むさらなる制限が、それぞれ 2022 年 1 月と 6 月に EU で発効されました（規制 [EU] ] 獣医学と規制に関する 2019/6 [EU] 薬用飼料に関する 2019/4)。その結果、離乳移行期における豚の生産性と健康状態を維持するための適切な代替食戦略を開発することが緊急に必要となっており、プロバイオティクスは有望なアプローチの 1 つとなっています。

プロバイオティクスは、「適切な量で投与すると、宿主に健康上の利益をもたらす生きた微生物」と定義されています4。バチルス属は胞子形成体であり、その結果、家畜に一般的に使用される他のプロバイオティック微生物、すなわちラクトバチルス、エンテロコッカス、およびサッカロマイセスに比べていくつかの利点を提供する。内生胞子を形成する能力により、Bacillus spp.が得られます。噴霧乾燥やペレット化などの製品配合や飼料加工作業中に遭遇する過酷な条件（低湿度や高温など）に対する耐性が向上し、生存率と保存期間が向上します5。さらに、バチルス胞子は胃内の酸性条件に耐性があり、それによって胃腸管（GIT）の通過を促進することが研究で示されています6,7。

Dou らによって行われた研究など 8 では、PWD を発症したブタの糞便微生物叢が、生後 7 日目から健康なブタの糞便微生物叢とは異なることが判明しており、幼少期の微生物叢の重要性が実証されています。このため、人生の早い段階で微生物叢を操作することが最も大きな影響を与えるはずであるという現在の考え方につながりました9。母親に飼料添加物を補給することは、直接補給する場合よりも人生の早い段階で子孫に有益な効果をもたらす可能性がある戦略の 1 つです。この母親の栄養補給戦略を使用して、バチルスベースのプロバイオティクスは、乳飲み豚の腸内病原菌の減少10、11、子豚の成長速度の向上10、11、12、下痢の発生率の減少12など、さまざまな利点を実証しました。最近、私たちの研究グループは、妊娠後期および授乳期にバチルス・アルティトゥディニス WIT588 胞子を補給された雌豚の子孫における生涯成長上の利点を実証しました13。仕上げ期間中、バチルスを補給した雌豚の子豚では体重の増加が観察され、最終的に屠殺時の屠殺時の屠殺重量と致死率の増加につながりました13。提案されている作用機序には、母豚の初乳の質の改善と、重要な離乳後早期（PW）期における子の小腸の吸収能力の強化が含まれており、飼料変換効率の観察された改善につながります13。腸の健康と栄養素の利用への寄与を考慮すると、腸内細菌叢の調節も要因である可能性があります14。したがって、この研究の目的は、母親および/またはPWにB. altitudinis WIT588胞子を補給することが、雌豚の糞便および初乳、および子の消化管および子の微生物叢の組成および/または多様性に影響を与えるかどうかを初めて決定することであった。妊娠後期から臨終期の終わりまでのさまざまな時点での糞便。

簡略化の目的で、結果セクションの残りの部分では雌豚治療群を次のように省略します。CON、対照食を与えた雌豚。 PROは、雌豚にプロバイオティクスを添加した飼料を与えたものです。同様に、子処理グループは次のように略記されます。CON/CON、対照雌豚から引き離され、対照食を与えられた子豚。 CON/PRO、対照雌豚から引き離された子豚にプロバイオティクスを添加した餌を与えた。 PRO/CON、プロバイオティクスを補給した雌豚から引き離され、対照食を与えられた子豚。そしてPRO/PROは、プロバイオティクスを補給した雌豚から引き離され、プロバイオティクスを補給した食事を与えられた子豚です。

初乳微生物の多様性に対する処理の効果を図 1a に示します。種の豊富さと均一性の尺度であるシャノンα多様性は、CON 雌豚と比較して PRO 雌豚の初乳では低かった (P < 0.05)。初乳のβ多様性に関しては、処理に基づくクラスター化はありませんでした（補足図S1）。

シャノンα多様性に対する雌豚処理の影響 (A)、および雌豚の初乳内の放線菌の平均相対存在量 (B) およびロチア (C)。母親の治療: CON コントロールと PRO プロバイオティクス。各サンプリング時点内の処理間の有意差は *P < 0.05 として示されます。

初乳サンプルでは、合計 15 門、82 科、190 属が同定されました。ファーミクテス属とアクチノバクテリオタ属が主な門であり（補足図S2a）、主な属はブドウ球菌、コリネバクテリウム、ロチアでした（補足図S2b）。差次的に豊富な分類群が補足表S1に示されており、細菌の門と属の平均相対存在量がそれぞれ補足図S2aおよびS2bに示されています。門レベルでは、CON 雌豚と比較して PRO 雌豚の初乳には放線菌がより豊富に存在していました (P < 0.05、図 1b)。属レベルでは、PRO 雌豚の初乳には、CON 雌豚と比較して、Rothia (P < 0.05; 図 1c) および Globicatella (P < 0.01) の存在量が多く、Vagococcus の存在量は低かった (P < 0.01)。 Rothia 属に割り当てられた配列の BLAST 検索により、R. marina、R. endophytica、R. nasimurium、および R. mucilaginosa を含むいくつかの一致が得られました。

雌豚の糞便サンプルのどのサンプリングポイントでも、シャノンα多様性に対する処理の影響はありませんでした（補足図S3a）。一般に、雌豚の治療に関係なく、微生物の多様性は授乳期間中に減少するようです。糞便微生物叢のβ多様性は、重み付けされていないUniFrac多次元スケーリング(MDS)プロットを使用して表されます(補足図S3b)。サンプルは治療法（コントロールまたはプロバイオティクス）に従ってクラスター化されませんが、サンプリング時点に基づいて分離されます。妊娠中および分娩時に収集されたサンプルは、授乳中に収集されたサンプルとは別にクラスター化されます（授乳および離乳の 13 日目）。。

すべてのサンプリング地点にわたる雌豚の糞便から、合計 15 門、73 科、157 属が同定されました。ファーミクテス属とバクテロイド門は、すべてのサンプリングポイントで見つかった主な門であり（補足図S4）、スピロヘータ科、プレボテラ科、オシロスピラ科、およびリケネラ科が主な科でした（データは示されていません）。どの採取点においても、雌豚の糞便サンプルにおいて、門、科、または属レベルでプロバイオティクスの補給による差異は見られませんでした。

サンプリング時点間で子孫の糞便サンプルのα多様性に差はありませんでした（P > 0.05;補足図S5）。回腸内の微生物のα多様性に対する治療効果があり（図2a）、PRO/PROグループではCON/CONグループ（P < 0.05）およびPRO/CONグループ（P = 0.05）、後者の傾向がありましたが。盲腸または直腸における微生物の多様性には、治療に関連した差異はありませんでした。

子の消化器におけるシャノンα多様性（A）、およびすべてのサンプリングポイントにおける子の糞便および消化器中の微生物叢の重み付けされたUniFrac距離（β多様性）に対する母親および離乳後の治療の影響（B）。治療法は次のとおりです (母親の治療/離乳後治療): CON/CON、CON/PRO、PRO/CON、PRO/PRO。ここで、CON はコントロール、PRO はプロバイオティクスです。各サンプリング時点内の処理間の有意差は、*P < 0.05 および †0.05 < P < 0.10 として示されます。色はサンプルの種類とブタがサンプリングされた時点を示します (離乳、d27_PW、d56_PW、および d118_PW の時点で収集されたサンプルは糞便サンプルです)。 NMDS、非計量多次元尺度法。

糞便および消化器微生物叢のβ多様性は、加重UniFrac非計量MDS（nMDS）プロットを使用して表され、治療グループ間の差異を評価します（図2b）。全体として、サンプリングポイント/サンプルの種類に応じて、いくつかのクラスターがありました。興味深いことに、授乳開始 13 日目に採取された糞便サンプルは、離乳日 (授乳開始 26 日目) に採取された糞便サンプルとは別にクラスター化されました。これら 2 つのグループも、PW で収集されたサンプルとは別にクラスター化されました。 PW 8 日目、27 日目、56 日目、および 118 日目に採取された糞便/消化器サンプルは、PW 8 日目の回腸消化物サンプルを除き、分離していないようです。例外として、他のサンプル/サンプリング時点とは別にクラスター化されます。順列分散分析により、PW 8 日目の回腸消化物の加重 UniFrac メトリックが、他の糞便/消化物サンプルの加重 UniFrac メトリックとは異なることが示されました (P < 0.05)。同様に、重み付けされた UniFrac メトリクスは、離乳時の糞便と他の糞便/消化物サンプルの間 (P = 0.08)、および PW 8 日目の盲腸と他の糞便/消化物サンプルの間 (P = 0.08) で異なる傾向がありました。

すべての採取点にわたって、子の糞便および消化物のサンプルから合計 16 門、99 科、248 属が同定され、主な門はファーミクテス門とバクテロイド門でした。 PW 8 日目まで、3 番目に豊富な門はプロテオバクテリアであり、予想通り、PW 期初期 (PW 8 日目) に増加し、その後減少しました。離乳前 [授乳日 13 日目と 26 日目 (離乳)] の治療群間で特定されたすべての差異は補足表 S2 に示され、PW で収集されたサンプルの治療関連の差異はすべて補足表 S3 に示されます。離乳時の子の糞便中に異なる豊富な門と属を図 3 に示します。8 日目 PW の子の回腸消化器中のすべての細菌門と選択された異なる豊富な門の平均相対存在量 (%) を図 4 に示します。 20の最も豊富な属、および8日PWの回腸内で異なって豊富に選択された属を図1および2に示す。それぞれ5と6。子の糞便中に最も豊富な20の属と、d118 PWにおけるラクトバチルス属の平均相対存在量を図7に示します。

離乳時（26日目）の子の糞便中のシネルジストータ属（A）、アロプレボテラ属（B）、リケネラ科dgA-11腸グループ（C）およびラクノスピラ科NK4A136グループ（D）の平均相対存在量（%）に対する母親の治療の効果。授乳中）。母親の治療: CON コントロール、PRO プロバイオティクス。治療間の有意差は *P < 0.05 として示されています。 **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001。

離乳後 8 日目の子の回腸における細菌門 (A)、ファーミクテス属 (B)、バクテロイド門 (C) およびスピロヘトータ属 (D) の平均相対存在量 (%) に対する母親および離乳後の治療の影響。治療法は次のとおりです (母親の治療/離乳後治療): CON/CON、CON/PRO、PRO/CON、PRO/PRO。ここで、CON はコントロール、PRO はプロバイオティクスです。治療間の有意差は *P < 0.05、**P < 0.01 として示されます。

離乳後 8 日目の子の回腸における最も豊富な 20 属の平均相対存在量に対する母親および離乳後の治療の影響。治療法は次のとおりです (母親の治療/離乳後治療): CON/CON、CON/PRO、PRO/CON、PRO/PRO。ここで、CON はコントロール、PRO はプロバイオティクスです。

バチルス属 (A)、カテニバクテリウム属 (B)、ブラウティア属 (C)、リケネラ科 RC9 腸グループ (D)、プレボテラ科 (E) およびプレボテラ科 NK3B3A グループ (F) の平均相対存在量に対する母親および離乳後の治療の影響。離乳後8日目の回腸。治療法は次のとおりです (母親の治療/離乳後治療): CON/CON、CON/PRO、PRO/CON、PRO/PRO。ここで、CON はコントロール、PRO はプロバイオティクスです。治療間の有意差は *P < 0.05、**P < 0.01 として示されます。

最も豊富な 20 属 (A) およびラクトバチルス種の平均相対存在量 (%) に対する母親および離乳後の治療の影響。 (B) 離乳後 118 日目の子の糞便中。治療法は次のとおりです (母親の治療/離乳後治療): CON/CON、CON/PRO、PRO/CON、PRO/PRO。ここで、CON はコントロール、PRO はプロバイオティクスです。治療間の有意差は *P < 0.05、**P < 0.01 として示されます。

離乳前の相対存在量 1% を超える分類群の存在量には差はありませんでした。離乳時（授乳開始日26日）、CON雌豚から離乳した豚と比較して、PRO雌豚から離乳した豚の糞便中には、Synergistota門があまり存在しませんでした（P < 0.05;図3a）。属レベルでは、アロプレボテラ属（P < 0.05、図 3b）およびリケネラ科 dgA-11 腸グループ（P < 0.001、図 3c）はそれほど豊富ではなく、ラクノスピラ科 NK4A136（P < 0.05、図 3d）はより豊富でした。 PRO 雌豚から離乳した豚と CON 雌豚から離乳した豚を比較した。

回腸内のすべての細菌門の平均相対存在量を図4aに示します。 6 つの異なる豊富な門が特定されました (補足表 S3)。放線菌は、CON/CON グループと比較して、CON/PRO および PRO/CON グループでは豊富ではありませんでした（P < 0.01;図 4a）。ファーミクテスは、CON/CONグループと比較してPRO/PROグループでより豊富でした（P <0.05;図4a、b）。バクテロイドータは、CON/CON および PRO/PRO グループと比較して PRO/CON グループでより豊富であり (P < 0.01)、PRO/PRO グループと比較して CON/PRO グループでより豊富でした (P < 0.01;図)。 4a、c)。スピロヘトータは、CON / CONグループおよびPRO / PROグループと比較して、PRO / CONグループでより豊富でした（それぞれP <0.05およびP <0.01;図4a、d）。

53 の治療関連の差異が属レベルで特定されました (補足表 S3)。簡略化のため、ここではバチルス属を除き、相対存在量が 1% を超える属の有意差のみを報告します。最も豊富な 20 の属の平均相対存在量を図 5 に示します。クリセオバクテリウムは、CON/CON グループと比較して、CON/PRO、PRO/CON、および PRO/PRO グループでは豊富ではありませんでした（P < 0.01、P < 0.05）それぞれ、P < 0.001;補足表S3)。アロプレボテラは、CON/CON および PRO/PRO グループと比較して、PRO/CON グループでより豊富でした (それぞれ P = 0.05 および P < 0.05; 図 5)。トゥリシバクターは、CON/CON グループと比較して PRO/CON グループでより豊富でした (P < 0.01; 図 5)。ペリステガは、CON/CON グループと比較して CON/PRO グループでは豊富ではありませんでした (P < 0.05; 図 5)。ロチアは、CON/CON グループと比較して、PRO/CON および PRO/PRO グループでは豊富ではありませんでした (P < 0.05; 図 5)。 Terrisporobacter および Clostridium sensu stricto 1 は、CON/CON グループと比較して PRO/PRO グループでより豊富でした (P < 0.05; 図 5)。

Escherichia/Shigella は、CON/CON グループと比較して、CON/PRO、PRO/CON、および PRO/PRO グループでより豊富でした (P < 0.01、図 5)。 Escherichia/Shigella 属に割り当てられた配列の BLAST 検索により、多数の E. coli 株、S. Sonnei、S. flexneri、E. fergusonii、および Escherichia spp を含むいくつかの一致が得られました。

バチルス属は、CON/CON グループと比較して、CON/PRO グループと PRO/PRO グループでより豊富でした（それぞれ P < 0.001 および P < 0.01;図 6a）。カテニバクテリウムは、CON/CON グループと比較して PRO/CON グループでより豊富でした（P < 0.05;図 6b）。 Blautia は、CON/CON グループと比較して、PRO/CON および PRO/PRO グループでより豊富でした（それぞれ P < 0.05 および P < 0.01;図 6c）。リケネラ科 RC9 腸グループは、CON/CON グループと比較して、CON/PRO および PRO/CON グループでより豊富でした（P < 0.05;図 6d）。 Prevotella（P < 0.01;図6e）は、CON / CONグループと比較してPRO / CONグループでより豊富でした。 Prevotellaceae NK3B31 は、CON/CON および PRO/PRO グループと比較して PRO/CON グループでより豊富であり (P < 0.01 および P < 0.05)、PRO/PRO グループと比較して CON/PRO グループでより豊富でした (P<0.05)。 0.01;図6f)。

3 つの異なる豊富な属が PW 8 日目に盲腸で同定されました (補足表 S3)。トレポネーマは、CON/CON グループと比較して PRO/CON グループでより豊富でした (P < 0.05)。

2 つの異なる豊富な門が PW 8 日目に直腸内で特定されました (補足表 S3)。カンピロバクタータは、CON/CON、PRO/CON、PRO/PRO グループと比較して、CON/PRO グループでより豊富でした (P < 0.01)。

PW 日 27 日に収集された糞便サンプルでは、門レベルで 3 つの差異と属レベルで 2 つの差異が特定されました (補足表 S3)。ファーミクテス門は、PRO/CON および PRO/PRO グループと比較して、CON/PRO グループではあまり豊富ではありませんでした (P < 0.05)。 Prevotellaceae UCG 001 属は、CON/CON グループと比較して、PRO/CON および PRO/PRO グループでより豊富でした (P < 0.01)。ラクノスピラ科 ND3007 グループ属は、CON/CON グループおよび CON/PRO グループと比較して、PRO/PRO グループではあまり豊富ではありませんでした (それぞれ P < 0.001 および P < 0.05)。

56日目のPWに収集された糞便サンプルには、異なって豊富な属が1つありました（補足表S3）。アロプレボテラは、PRO/CON グループと比較して PRO/PRO グループで豊富に存在しませんでした (P < 0.05)。

8 つの異なる豊富な属が、d118 PW に収集された糞便サンプルで同定されました (補足表 S3)。乳酸菌（図7a、b）は、CON/CONおよびCON/PROグループと比較して、PRO/CONグループでより豊富でした（P <0.01）。サクシニビブリオ属およびラクノスピラ科 NK4A136 グループは、CON/PRO グループと比較して PRO/CON グループでの存在量が少なかった (P < 0.05)。

回腸内の SCFA 濃度に対する治療の効果を表 1 に示します。総 SCFA、総揮発性脂肪酸 (VFA)、総分岐鎖脂肪酸 (BCFA)、乳酸の濃度に対する治療の影響はありませんでした。または回腸消化物のプロピオン酸。ただし、酢酸の濃度は高く（5.62 vs 2.93 mmol/kg、SEM 0.912、P < 0.05）、吉草酸の濃度は低くなる傾向がありました（0.021 vs 0.042 mmol/kg、SEM 0.006、P = 0.099）。プロバイオティクス PW を投与されたブタの回腸消化器を、サプリメントを投与されていないブタと比較したもの。また、母親の治療効果が酪酸濃度に及ぼす傾向があり、プロバイオティクスを補給した雌豚から離乳した豚は、プロバイオティクスを補給していない雌豚から離乳した豚と比較して酪酸濃度が高かった（0.174 vs 0.100 mmol/kg、SEM 0.030、 P = 0.07)。

著者らの知る限り、これは母豚にバチルスベースのプロバイオティクスを補給した場合の、雌豚の初乳と糞便、子の消化物と授乳期から終了期までの糞便の微生物組成に対する影響を調べた最初の研究である。その結果、母親のプロバイオティクスの補給は雌豚の初乳の微生物組成に影響を与えるが、雌豚の糞便には影響を及ぼさないことが示された。母親からまたは直接 PW に補給した場合も、子の消化物および糞便 PW の微生物組成に影響を与えました。しかし、観察された効果のほとんどは、プロバイオティクスを補給した雌豚から離乳した豚であり、多くの潜在的に有益な効果が、PRO/CON 群の豚の回腸消化管では PW 8 日目に、この群の糞便では PW 118 日目に観察されました。。バチルス属存在量は1%未満ではあるが、母豚と直接治療を受けた子豚の両方の回腸消化管で、PW8日目に検出された。サンプリング時にプロバイオティクスを投与されたブタの回腸ではバチルス属の存在量が高かった（CON/PRO 群と PRO/PRO 群ではそれぞれ 0.87% と 0.39%、PRO/CON 群では 0.01%）。この所見は、投与された菌株の数と一致しており、これによりプロバイオティクスはCON/PRO群およびPRO/PRO群の回腸消化器で検出されたが、8日目のPWではPRO/CON群では検出されなかった（これは我々の並行出版物で以前に報告されている13）。同様に、Bacillus subtilis と B. licheniformis の組み合わせを成長期の豚に投与した場合、Kaewtapee et al.15 は、Bacillus 属に対応する操作分類単位 (OTU) が、栄養補給された豚と未摂取豚の両方の回腸に 1% 未満の存在量で出現したことを指摘しました。 -サプリメントを摂取した豚。しかし、我々がここで行っているような、治療動物と対照動物の間の存在量の違いは見つかりませんでした。これらの著者らは、回腸内でのバチルス属の検出は、低率ではあるが哺乳類の胃腸内で発芽できるため、存続できない可能性があることを示していると示唆した15,16。まとめると、これらの発見は、バチルスプロバイオティクスは小腸微生物叢内で優勢ではないが、投与された胞子はDNAベースの方法を使用して検出されるため発芽するように見え、DNA抽出により適した栄養細胞の存在を示唆していることを示唆しています胞子よりも17。

前述したように、B. altitudinis WIT588 は、サプリメントを摂取していない雌豚と比較して、サプリメントを摂取した雌豚の糞便から検出され、糞便中のプロバイオティクスの存在は、雌豚とその子孫の間でのプロバイオティクスの伝播の可能性が高いと考えられます。しかし、ここで行われた 16S rRNA 遺伝子配列分析では、雌豚の糞便細菌の多様性や組成に違いは見つかりませんでした。興味深いことに、妊娠中および分娩時の雌豚の糞便マイクロバイオームは、授乳中に観察されたものとは異なっていました。これは以前の研究結果 18、19、20 と一致しており、おそらく授乳中の食事、代謝、ホルモンの変化によるものと考えられます。

雌豚の糞便細菌の多様性と組成はプロバイオティクスの補給によって影響を受けませんでしたが、プロバイオティクスを補給した雌豚の初乳では両方のパラメータが変化しました。これは、糞便と比較して初乳の細菌多様性が低いためである可能性があります。群集の多様性が大きいほど、組成の変化に対する抵抗力が高まるからです 21,22。プロバイオティクスの補給により、初乳中の細菌の多様性が減少しました。腸内マイクロバイオーム内の多様性の減少は望ましくないことと考えられていますが、本質的に微生物群集が小さく機能も少ない初乳における微生物多様性の減少の影響についてはほとんど知られていません。したがって、初乳マイクロバイオーム内では高レベルの微生物の多様性は必要ない可能性があります。さらに、多様性の喪失は、微生物の機能の喪失と必ずしも一致するとは限りません。たとえば、土壌微生物群集は、たとえ微生物の多様性が減少したままであっても、機能を回復する可能性があります21。重要なのは、本研究で観察されたプロバイオティクス投与による初乳の細菌多様性の減少は、すでに発表された発育成績に関する並行研究で報告されているように、離乳前後の子供の成長や健康に対する悪影響とは関連していなかったということです13。。

比較できる研究はほとんどありませんが、この研究で初乳で特定された主な門 (ファーミクテス属と放線菌) と属 (ブドウ球菌、コリネバクテリウム、ロチア) は、雌豚の初乳と牛乳に関する以前の観察と一致しています 23。プロバイオティクスを添加した雌豚の初乳中の放線菌門の相対存在量が対照豚と比較して高いのは、おそらく Rothia 属の存在量が増加したことに起因すると考えられます。ロチア属は、ヒト、ブタ、げっ歯類の一般的な口腔、皮膚、腸の共生生物であり 24,25,26 、これまでにブタ、ヒト、ヤギ、ラットの乳中にも発見されています 24,25。ロチア属として口腔や皮膚に存在するため、雌豚の乳首または子豚の口に由来する可能性があります27,28。ただし、皮膚からの汚染を防ぐために、サンプリング前に乳首を洗浄しました。初乳中に特異的に豊富に含まれると同定された配列は、環境（R. marina および endophytica）として分類されるいくつかの Rothia 種と一致するが、動物種（R. nasimurium）およびヒトの日和見病原体と考えられる 1 種（R.粘液腫）。初乳中の微生物組成で観察された差異は、プロバイオティクスを補給した雌豚の初乳の栄養組成の変化によるものと考えられます。これは、以前に報告されたように、プロバイオティクスを補給していない雌豚の初乳よりもタンパク質濃度が高く、乳糖濃度が低かったのです。私たちの並行出版物13。初乳組成の変化は、プロバイオティクスの補給による腸の健康および/または雌豚の胃腸管の酵素活性の改善に関連する、栄養素の消化と吸収の改善によって引き起こされる可能性があります29。ロチア属は炭水化物とタンパク質を発酵させることができ 30,31、研究では、培地にグルコースやスクロースと比較して乳糖を補充すると、経口共生生物である Rothia mucilaginosa の増殖が減少することがわかりました 30。したがって、対照雌豚の初乳中のロチアの存在量が低いことは、初乳中の乳糖濃度が高いことに関連している可能性があります。プロバイオティクスを補給した雌豚の初乳中の微生物組成の変化について考えられるもう 1 つの説明は、血流を介した雌豚の胃腸から乳腺への細菌の移行です。これは乳腸経路と呼ばれます。ブタ、ウシ、ヒト、マウスを対象とした多くの研究により、この理論を裏付ける証拠が得られています 32,33,34。しかし、この経路による初乳組成の変化を見るためには、まず雌豚の腸内細菌叢に影響を与える必要がありますが、雌豚から腸内サンプルを採取することができなかったため、これを確認することはできません。つまり、我々が結論付けることができるのは、糞便微生物叢には影響がなかったということです。それにもかかわらず、子豚に最も大きな影響が見られたのは回腸微生物叢内であったため、雌豚の腸内微生物叢はプロバイオティクスによって調節されている可能性があります。

母豚がまだ母豚に乳を飲んでいる間、およびPW期の初期に、母親のプロバイオティクスの補給が子の微生物叢の組成に影響を与えることが予想されました。しかし、ほとんどの影響は、PW 8 日目の回腸消化管、PW および終了期に採取された糞便サンプルで検出されました。バチルスベースのプロバイオティクスを雌豚に補給した研究はほとんどなく、その中でも子の微生物叢への影響を測定した研究はさらに少ない。 Baker et al.10 は、現在は時代遅れの末端制限断片長多型技術を使用して、母体にバチルスを補給した後、授乳開始 3 日目と 10 日目に子の回腸および結腸微生物叢に有益な変化が起こることを発見しました。本研究において、PW8日目の回腸消化器で確認された細菌存在量の多数の差異を考慮すると、哺乳期間中にそこでも差異が検出された可能性がある。しかし、授乳中の子孫から腸内容物は採取されませんでした。

ブタの幼少期の腸内微生物叢は母乳微生物叢の影響を強く受けることが示されているため、PW 初期にプロバイオティクスを補給した雌豚から生まれた子の腸内微生物叢内で観察される変化は、初乳微生物叢の変化に関連している可能性があります35。。プロバイオティクスを与えられた雌豚から離乳した豚は、離乳時に、植物多糖類の発酵と酪酸の生成に関連する科であるラクノスピラ科をより豊富に持っていました36。酪酸は結腸細胞の優先的なエネルギー源です37。水、ナトリウム、カリウムの吸収を促進し、ヒストン脱アセチル化酵素の発現を阻害することで遺伝子発現を調節し、宿主防御ペプチドの発現を増強し、抗菌活性を介して腸の健康を高める可能性があります38,39。したがって、プロバイオティクスを補給した雌豚からの子孫におけるラクノスピラ科の存在量の増加は、腸の完全性と栄養素の吸収の点で利点がある可能性があります。これは、これまでに報告されている、PW 8 日目の小腸組織学パラメーターの正の調節、PW の最初の 14 日間に観察された飼料効率の改善、およびその後のプロバイオティクスを補給した雌豚からの子の成長の改善を説明するのに役立つ可能性があります 13。 VFA は離乳時に測定されませんでしたが、プロバイオティクスを補給した雌豚から離乳したブタの PW 8 日目に採取された回腸消化物では酪酸が増加する傾向がありました。これは、以前に報告されている、PW13 日目に観察された、プロバイオティクスを補給した雌豚から引き離された子の十二指腸と回腸における絨毛の高さの改善に寄与した可能性があります。酪酸は結腸細胞の優先的なエネルギー源ですが、小腸での細胞の増殖と成長も刺激します (Liu40 によるレビュー)。離乳した豚にさまざまな形の酪酸塩を経口補給すると、小腸の形態が改善され 41、42、43、44、45、消化酵素活性が増加し 44、下痢の発生率が減少しました 43。プロバイオティクス PW を投与された子豚の回腸消化器では酢酸が上昇しました。酢酸は末梢組織によって代謝され、宿主にエネルギーを提供します46。したがって、我々の並行研究ではこれらの動物に成長の改善は見られなかったが、この回腸酢酸濃度の増加は食事からのエネルギー回収の改善に寄与する可能性がある13。

プロバイオティクスを介した効果のほとんどは、PW 8 日目の子の回腸微生物叢内で見られ、ほとんどの違いは、プロバイオティクスを補給した雌豚から離乳し、無添加飼料 PW (PRO/CON) を与えた豚と、プロバイオティクスを補給しなかった雌豚から離乳し、無添加飼料 PW (PRO/CON) を与えた豚との間で発生した。サプリメントを摂取していない食事 PW (CON/CON) グループ。現時点では、離乳時の食事の変化によって引き起こされる混乱の結果、微生物叢はより可塑的になる可能性があります47。バクテロイドータの存在量は、CON/CON グループと比較して PRO/CON グループで高かった。この門の豊富さは PW48 を増加させることが以前に示されており、PW の食事の変化と関連しています。本研究では、その存在量の増加は、PRO/CON グループにおける Prevotellaceae 科 (Prevotella、Alloprevotella、および Prevotellaceae) のメンバーの存在量の増加と関連している可能性があります。この科のメンバー、例えば Prevotella spp. は、キシラナーゼ、マンナナーゼ、β-グルカナーゼを使用して穀物の細胞壁の多糖類を分解することができるため 49,50,51、未消化の炭水化物の発酵に関与し、その結果生じる VFA の生成に関与します。これにより、ホストのエネルギー収集の増加に貢献します。したがって、プレボテラ科のメンバーのこの豊富さの増加は、プロバイオティクスを補給した雌豚からの子孫における最初の14日間のPW中の飼料効率の向上と、我々の並行出版物で以前に報告されたこれらの動物のその後の成長の改善を説明するのに役立つ可能性があります13。ブタの腸におけるプレボテラの役割に関するデータは矛盾していますが、最近の調査では、飼料効率と成長との正の関連性を示す研究の数が、負の相関を示す研究よりも多いと結論付けられています14。ファーミクテス門に属するブラウティア属およびツリシバクター属も、CON/CON 群と比較して PRO/CON 群で増加しました。 Blautia は炭水化物の発酵にも関与しており、最近、Turicibacter がブタの体重と正の相関があることが示されました 52。ブラウティアは、酪酸を生成するラクノスピラ科のメンバーであり、炎症性疾患や代謝性疾患の緩和に関与し、バクテリオシンの生成により抗菌活性を有すると考えられています53,54。ブラウティアは豚の飼料効率とも正の相関関係にあります55。ルミノコッカスやローズブリアなど、酪酸産生に関連する他のいくつかの属も、PRO/CON グループの回腸消化管で増加しました。酪酸を生成する属は、ブチリル-コエンザイム A: 酢酸 CoA-トランスフェラーゼ経路で酢酸を使用することがよくあります 55,56。 Prevotella spp. も大量に増加しており、酢酸塩生産者であるため、このプロセスを促進できます 51,57,58。したがって、PRO/CON グループの回腸消化管における酢酸と酪酸の生成物質の増加が組み合わさって、プロバイオティクスを補給した雌豚から離乳したブタの回腸消化管における酪酸濃度の上昇に寄与した可能性があります。興味深いことに、118 PW では、CON/CON および CON/PRO グループと比較して、PRO/CON グループで乳酸菌がより豊富でした。乳酸菌属これらは有益であると考えられており、病原体の競合的排除、抗酸化活性、免疫調節を通じて腸の健康を強化すると考えられています59。さらに、飼料効率の高い豚の大腸には乳酸菌が一貫して豊富に含まれています14。離乳豚と仕上げ豚にバチルスプロバイオティクスを直接補給した他の研究でも、ラクトバチルスが増加したことが示されています60,61。

PW 8 日目の回腸消化管におけるファーミクテスの存在量は、CON/CON グループと比較して PRO/PRO グループで増加しました。この門は VFA 産生と全身免疫反応の調節に寄与し、エネルギー節約、日和見病原体の抑制、炎症からの保護に寄与すると考えられているため、これは有益であると考えられる62。ファーミクテス属では、Clostridium sensu stricto 1 と Terrisporobacter が CON/CON グループと比較して PRO/PRO に多く存在しました。これらの属は両方ともブタの回腸微生物叢の共通構成要素です 63,64。加齢に伴う Clostridium sensu stricto 1 の有意な増加がブタ PW で以前に観察されており、腸の成熟の増加と関連している可能性があることが示唆されています 65。シャノン α 多様性は、CON/CON および PRO/CON グループと比較して、PRO/PRO グループのブタの回腸で減少しました。高レベルの細菌の多様性は、多くの場合、生態系の安定性、病原体の侵入に対する抵抗力、免疫系の発達と関連しています66。これらの関連性にもかかわらず、ZnO を補給した豚では多様性の低下がしばしば観察され、成長パフォーマンスや腸の健康パラメータの改善と定期的に関連しています 67,68。我々の並行出版物で以前に報告されているように、本研究における細菌多様性の減少は、豚の成長や健康に対する悪影響とは関連していませんでした（実際にはその逆でした）。バチルス胞子の投与は、抗生物質を投与された子豚と比較して、子豚の糞便微生物叢のα多様性を減少させることが以前に示されています69。私たちのグループが完了した別の研究では、ここで使用したのと同じバチルス胞子を週56日間補充したブタでは、週28日間だけ補充した豚や抗生物質とZnOの組み合わせを補充した豚と比較してα多様性が低かった70。これは、補給期間が細菌の多様性に対するバチルス胞子の補給の影響に影響を与える重要な要素であることを示唆しています。

Escherichia/Shigella 属の存在量は、CON/CON グループと比較して、3 つのプロバイオティクスを補給したグループすべてで高かった。以前、同じプロバイオティクス株がインビトロでブタの病原性大腸菌を減少させることが示されました71。この株をブタ PW に直接補給すると、回腸内の大腸菌が減少しました。しかし、どの大腸菌分離株も溶血活性を持たず、これらが共生種であることを示唆しています72。研究全体での所見の一貫性のなさは、使用した実験方法の違い、つまり、インビトロとインビボ、従来の培養と 16S rRNA 遺伝子配列決定の違いによるものと考えられます。エシェリヒア属とシゲラ属は、16S rRNA 遺伝子配列決定を使用して区別することはできず、BLAST 検索により、今回の研究で異なって豊富な配列がいくつかの大腸菌株、他のエシェリヒア属の菌株と一致することが判明しました。そしていくつかの赤癬菌属。したがって、実際にどの種/血清型が増加しているかを判断することはできません。 Escherichia/Shigella 属は、下痢のあるブタでより豊富であることが示されています 73 が、これは回腸サンプルではなく直腸サンプルであり、PW 期ではなく授乳中に発生しました。実際、大腸菌/赤癬菌は一般に健康なブタの回腸に豊富に存在しており、いくつかの研究では最大 23% 存在しており 63、赤痢菌属の菌は 63 です。豚に病気を引き起こすことは知られていません74。現在の研究で血清型がリスト化された主な配列一致の 1 つは大腸菌 0157:H7 で、これはヒトに病気を引き起こす食品由来の病原体です。ブタはこの血清型を保有している可能性がありますが、通常、ブタの病気と関連することはありません 75。ブタの障害を引き起こす主な大腸菌血清型は 014976 ですが、これは BLAST 検索では特定されませんでした。さらに、我々の並行出版物で報告されているように、本研究のどの治療群でも下痢は観察されず、プロバイオティクスを補給した雌豚から離乳した豚の十二指腸と回腸では絨毛の高さが改善されました13。これらのブタの成長成績と症状の欠如 13 は、この研究で検出された配列が病原性種ではなく共生生物に属していることを示唆しています。実際にその配列が共生種を表している場合、同じ種の菌株は異なる種の菌株よりも同じ生態的ニッチを占める可能性が高いため、その存在量の増加により、プロバイオティクスを補給されたブタの病原菌株による定着に対する感受性が低下する可能性があります77。。しかし、現在のデータからは、異なる量で存在する大腸菌/赤癬菌の種/株が、適切な条件下では毒性を生じないと結論付けることはできません。

この研究の新規性は、母親とPWのプロバイオティクスの補給が微生物叢に及ぼす影響が、出生から出産期まで雌豚の初乳と糞便、および子の消化器/糞便で観察されたという事実にある。データは、妊娠後期および授乳期を通じて母親に B. altitudinis 胞子を補給した方が、PW を直接補給した場合よりも腸内微生物叢に大きな影響を与えたことを示しています。これらの発見は、幼少期のマイクロバイオーム操作が母親からの栄養補給によって達成できるという仮説を裏付けるものである。本研究では、初乳組成と初乳マイクロバイオームの操作によって子のマイクロバイオームの調節が起こっているようだが、以前に報告されているように、雌豚の糞便中のプロバイオティクスの存在にも関連している可能性がある。プロバイオティクスを補給した雌豚の子孫は、PW期初期に回腸での複雑な炭水化物の分解と栄養素の利用に関連する細菌分類群の量が増加していました。これは、並行出版物ですでに報告されているように、この期間中に観察された飼料効率と腸の形態の改善を促進する可能性があります。プロバイオティクスを補給した雌豚（プロバイオティクスを補給しなかった）の子において、PW後期に乳酸菌の存在量が増加したことは、この群で観察された仕上げ期の成長の改善と、その結果としての屠体重量の増加に寄与した可能性がある。以前に報告されました。結論として、本研究の結果は、B. altitudinis を補給した雌豚の子の初期の PW 腸内微生物叢が PW シリアルベースの食餌の消化により適していることを示唆しており、これは以前に報告された改善を説明するのに役立つ可能性があります。飼料効率と枝肉重量。豚はPW8日目から個別に飼育されているため、観察された反応が商業的な集団飼育実践でも見られるかどうかを解明するには、さらなる研究が必要である。

この研究で分析された初乳、糞便、腸のサンプルは、Crespo-Piazuelo らによって行われた以前の研究中に収集されたものです。実験計画、動物の飼育と管理、およびプロバイオティクスの胞子の調製に関する材料と方法は、ここで簡単に概説されていますが、詳細は Crespo-Piazuelo et al.13 の出版物で入手できます。

この研究の倫理的承認は Teagasc 動物倫理委員会 (承認番号 TAEC148/2017) によって付与され、プロジェクトは健康製品規制当局 (プロジェクト承認番号 AE19132/P066) によって承認されました。実験は、アイルランドの法律 (SI no. 543/2012) および科学目的で使用される動物の保護に関する EU 指令 2010/63/EU に従って、ARRIVE ガイドラインに従って実施されました。

実験は 2 × 2 階乗配置として設計されました。簡単に説明すると、妊娠 100 日目に 24 頭の雌豚（ラージホワイト × ランドレース）が選択され、出産数（前産子 1 ～ 4 頭）、体重（209 ～ 311 kg）、および(1) 標準的な妊娠および授乳期の管理食 (CON、n = 12)、または (2) B. altitudinis WIT588 を添加した標準的な妊娠および授乳期の食餌のいずれかにランダムに割り当てられます。胞子（妊娠 100 日目から分娩まで毎日約 4 × 109 個の胞子、および授乳期間中は離乳までの 26 日間毎日約 1.2 × 1010 個の胞子、以下に概説するように投与；PRO、n = 12）。子豚の交雑養育は、必要に応じて産後24時間から48時間の間に実施し、同腹子数（同腹子当たり14頭の子豚）を均等化したが、これは同じ治療群内でのみであった。

離乳時に、同腹子の平均体重 (7.27 (標準偏差 0.168) kg) と性別のバランスに基づいて、すべての同腹子からこれらの雌豚から 144 頭の子豚 (n = 72/雌豚処理) が選択されました。子豚は雌豚の治療法、性別、体重、産子によってブロックされ、無作為に食餌療法に割り当てられました。両方の雌豚の治療から得た子豚を同性ペアとして 28 日間の CON (プロバイオティクス不使用) または PRO (プロバイオティクス添加) 治療のいずれかに割り当て、結果として 4 つの治療グループ (n = 36 頭の子豚/治療) が得られました。 (1) 子豚CON 雌豚から離乳し、CON 食（CON/CON）を与えた。 (2) CON 雌豚から離乳され、PRO 飼料 (CON/PRO) を与えられた子豚。 (3) PRO 雌豚から離乳され、CON 食（PRO/CON）を与えられた子豚。 (4) PRO 雌豚から離乳され、PRO 食餌を与えられた子豚 (PRO/PRO)。これらのブタのサブセットは、以下に概説するようにサンプリングされました。プロバイオティクスの補給は、以前に記載されているように 13 、また以下に概説されているように、毎日飼料にトップドレッシングされた約 1 × 109 個の B. altitudinis WIT588 胞子から構成されていました。プロバイオティクスの補給はPWの28日目に終了しましたが、サンプルはPWの118日目（終了期間の終わり）まで収集されました。

すべての雌豚と子の飼料の成分組成と栄養素含有量を補足表S4に示します。飼料の配合と飼料と水の供給の詳細は、Crespo-Piazuelo et al.13 によって説明されています。

Bacillus altitudinis WIT588 は、B. altitudinis NCIMB 43558 (WIT572) のリファンピシン耐性変異株であり、in vitro および in vivo の両方でブタのプロバイオティクスとして特徴づけられる海藻由来の分離株であり、ブタの GIT における計数を容易にするために使用されました 13,71,72。 ,78。この菌株は、gyrB および pyrE 遺伝子の配列決定に基づいて最初は Bacillus pumilus と呼ばれていました 72 が、その後、全ゲノム配列決定 (未発表データ) に基づいて B. altitudinis と同定されました。 B. altitudinis WIT588 胞子は、Prieto et al.72 によって以前に記載されているように調製し、滅菌水に懸濁し、等分して、使用するまで -20 °C で保存しました。投与の朝、解凍した胞子懸濁液を蒸留水で必要な用量まで希釈し、Crespo-Piazuelo et al.13 の記載に従って飼料に追肥しました。

母豚と子の飼育と管理については、Crespo-Piazuelo et al.13 によって詳細に説明されています。簡単に説明すると、相互汚染を最小限に抑えるために、PRO 雌豚を CON 雌豚とは別に飼育しました。分娩舎 (2.5 m × 1.8 m) には、部分的にすのこ状の床の上に子豚用の加熱床パッドを備えた分娩箱がありました。分娩室の温度は自動的に制御され、分娩時には約 24 °C に維持され、授乳 7 日目までに徐々に 21 °C まで下がりました。離乳時、子豚は同性ペアで 4 つの部屋の 72 の囲い (n = 2 頭の豚/囲い) に収容され、治療は各部屋に均等に分配されました。ペン (1.2 m × 0.9 m) はプラスチック製の床材で完全にスラットで覆われていました (Faroex、マニトバ州、カナダ)。プロバイオティクスの相互汚染を防ぐために、処理の間に空のペンを残しました。 PW 8 日目に、消化物のサンプリングを容易にするために、40 頭のブタ (n = 10/治療) を捕獲ボルトによる気絶とそれに続く放血によって屠殺しました。同時に、残りの囲い (32 の囲い) のそれぞれから 1 頭のブタを試験から除外し、残りの子豚 (n = 72) を個別に PW 55 日まで囲い込みました。離乳食部屋の温度は、PWの最初の7日間は28℃に維持し、PWの28日目までに22℃まで徐々に下げ、PWの56日目まで22℃に維持した。 PW 56 日目に豚を 4 つの仕上げ室の 1 つに移動し、実験期間の終了 (PW 118 日目) まで完全にスラット付きの囲い (1.81 m × 1.18 m) に個別に入れました。気温は20～22℃に保たれました。

雌豚と子のサンプリング中は、次のように処理間の相互汚染を防ぐために厳格な衛生対策を講じました。プロバイオティクスを投与されていない豚が最初に扱われ、次にプロバイオティクス治療グループが続きました。手袋は豚ごとに交換し、新しい使い捨てオーバーオールを職員全員が着用し、各治療グループのサンプリングを開始する前に交換した。使用したすべての機器は、その後のサンプリングでの相互汚染を防ぐために、使用後に 1% Virkon® で徹底的に消毒されました。

初乳サンプル (n = 12 頭の雌豚/治療) は、分娩後 4 時間以内に乳房の片側の雌豚の頭のすぐ遠位にある最初の 4 つの乳首を手動で搾乳することによって収集されました。サンプル収集前にヨウ素を使用して乳頭周囲の領域を徹底的に洗浄し、初乳の最初の 1 ml を廃棄しました。サンプル (滅菌チューブ入り 2 × 4.5 ml) を液体窒素中で急速冷凍し、分析まで -80 °C で保存しました。

糞便サンプルは、妊娠 100 日目、分娩時、授乳 13 日目、および同腹子の離乳時 (授乳 26 日目まで) に、穏やかなデジタル刺激を使用して直腸から直接雌豚 (n = 24) から採取されました。離乳前の直腸スワブは、滅菌ビスコースチップスワブ (Sarstedt Ltd、Drinagh、ウェックスフォード、アイルランド) を使用して、授乳開始 13 日目までの子から採取されました (1 回の治療につき n = 12 匹のブタの反復)。糞便サンプルは、離乳時にデジタル直腸刺激によって取得しました。、同じ豚からの 13 日目 PW、28 日目 PW および 56 日目 PW (治療ごとに n = 10 匹の豚) および新たに排泄された糞便サンプルを 118 日目 PW に収集しました (CON/CON では n = 5、CON/PRO では n = 4、nそれぞれ、PRO/CON の場合は = 4、PRO/PRO の場合は n = 6)。直腸スワブは-80℃で保存する前に氷上に置き、糞便サンプルは滅菌チューブに収集し、液体窒素中で即座に急速冷凍し、分析まで-80℃で保存しました。

40 頭の子豚 (1 回の治療につき n = 10 頭) を、PW の 8 日目に捕虜気絶とそれに続く放血によって人道的に屠殺し、腸管全体を直ちに切除しました。回腸 (回腸盲腸接合部の近位 15 cm)、盲腸 (終端)、および直腸からの消化器サンプルを無菌チューブに無菌的に収集し、液体窒素中で瞬間凍結し、分析まで -80 °C で保存しました。

QIAamp DNA 便ミニキット (Qiagen、クローリー、英国) を製造業者の指示に従って使用し、ビーズ叩解ステップの追加と溶解温度を 95 °C に上げること以外は、直腸スワブ、糞便および消化物のサンプルから全 DNA を抽出しました。 DNA収量を増加させる79。バッファー ATE の量も 200 μl から 30 μl に減らし、遠心分離の前にスピンカラムのフィルター膜上に 5 分間放置しました (両方とも DNA 濃度を最大化するため)。直腸スワブからの抽出のために、1 ml の滅菌リン酸緩衝生理食塩水を各スワブに加え、2 分間ボルテックスしました。次いで、得られた液体を滅菌1.5mlチューブに移し、14,000rpmで2分間遠心分離した。上清を廃棄し、残ったペレットを DNA 抽出に使用しました。糞便および消化物のサンプルについては、各サンプル 0.25 g を抽出に使用しました。

DNeasy PowerFood Microbial Kit (Qiagen) を使用して、初乳サンプルから全 DNA を抽出しました。製造業者の指示に従い、次のようにいくつかの変更を加えた。(1) 最初の均質化ステップを省略した。 (2) 合計 5.4 ml の初乳を処理するために、1.8 ml の初乳を 2 ml 採集管に 3 回加えました。 (3) ペレット形成を最大化するために、最初の遠心分離ステップの時間を 15 分間に延長しました。（４）再懸濁した細胞を、オートクレーブ処理したジルコニアビーズ（０．１ｍｍの０．１２５ｇおよび１．０ｍｍの０．１２５ｇ、２．５ｍｍの単一ビーズ；ＳｔｒａｔｅｃｈＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、英国イーリー）を含むネジ蓋付きチューブに加え、ビーズを叩解した。 DNA の切断を防ぐために、PowerBead チューブ内でボルテックスする代わりに 3 分間、その後 1 分間休息し、次に 2 分間、その後 1 分間休息を実施しました。 (5) 最終ステップでは、溶出バッファーの量を 100 μl から 20 μl に減らし、遠心分離の前にスピンカラムのフィルター膜上に 5 分間静置して DNA 濃度を最大化しました。

微生物プロファイリングは、Illumina MiSeq プラットフォームで 600 増幅サイクル後の 16S rRNA 遺伝子の V3 ～ V4 領域のハイスループットシークエンシング (2 × 300 bp のペアエンドリード) を使用して実行されました。イルミナが推奨する 16S メタゲノムライブラリーの調製 (Nextera) プロトコールに従いました。すべてのサンプルのペアエンドリードは FastQC (v0.11.7)80 を使用して品質評価され、BBTools スイート (https://jgi.doe.gov/data-and-tools) の BBduk を使用して品質トリミング (cuttoff-phred = 20) されました。 /bbtools/)。プライマーと低品質のリードテールもこのステップで除去されました。 DADA2 パイプライン 81 を使用して、リードフィルタリングと複製解除、キメラの検出と削除、リードペアのマージ、各サンプルのアンプリコン配列バリアント (ASV) の推論を実行しました。分類法は、SILVA データベース (バージョン 128) に対して単純なベイジアン分類法を使用して、派生した各 ASV に割り当てられました82。可能であれば、SILVA データベースと正確に一致する配列の分類学的割り当てを使用するか、米国国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) のヌクレオチドデータベースに対して配列をブラストすることによって、種レベルの分類が特定されました (https://blast.ncbi で入手可能) .nlm.nih.gov/Blast.cgi)。アルファ多様性指数 (Shannon) およびβ多様性 (UniFrac) 分析は、R バージョン 4.0284 の phyloseq パッケージ 83 を使用して計算されました。 UniFrac 距離行列に基づく nMDS および MDS プロットが実行され、その後、R バージョン 4.0284 の ggplot2 パッケージ 85 を使用してプロットされました。

回腸消化物の短鎖脂肪酸プロファイルは、ピバリン酸（Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いたガスクロマトグラフィー（GC; Agilent Technologies、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）を使用して、Alimetrics Diagnostics（エスポー、フィンランド）によって決定されました。 ) 内部標準として使用されます。クロマトグラフィー手順は、80/120 Carbopack B-DA/4% Carbowax 固定相、キャリアガスとしてのヘリウム、および水素炎イオン化検出器 (FID) が充填されたガラスカラムを使用し、Apajalahti et al.86 によって以前に説明されています。乳酸および VFA (酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、酪酸、2-メチル酪酸、イソ吉草酸、吉草酸) は、クロロギ酸フェニル試薬を使用してそれぞれのフェニルエステルに誘導体化されました。得られたエステルを Agilent GC-FID (Agilent Technologies) で分析しました。酪酸-d7-および酢酸-d3酸を使用したマトリックス適合内部標準キャリブレーションを定量に使用しました。

OTU 存在量の統計分析は、R バージョン 4.0284 の DeSeq287 を使用して実行されました。存在量の少ない ASV は手動でフィルタリングされ、すべてのサンプルにわたるその ASV のリードの合計がすべての ASV の 0.005% を超えた場合、ASV は保持されました。 0.05 未満の誤検出率は、グループ間の有意な存在量差を示しています。各分類群について、R パッケージ Metacoder88 の Wilcoxon Rank Sum 検定を使用して、各治療グループのサンプル存在量中央値間の差異を評価しました。重み付けされた UniFrac 距離行列を順列分散分析に供し、さまざまな時点でのサンプルの微生物群集構造に対する処理の有意な効果をテストしました。すべての分析の結果は、調整された P 値を使用して表示されます。

回腸SCFA結果の統計分析のために、SAS 9.4（ノースカロライナ州ケアリーのSAS Institute Inc.）のUNIVARIATE手順内のShapiro-WilkテストおよびKolmogorov-Smirnovテストを使用してデータを最初に調査しました。データは正規分布していないため、ログリンク機能とガンマ分布を備えた SAS の GLIMMIX プロシージャを使用してさらに分析しました。 ilink 関数を使用して、データを元のスケールに逆変換しました。このモデルには、固定効果としての母親とPWの治療効果と、それらに関連する相互作用が含まれていました。個々のブタが実験単位でした。 t 検定を使用して治療グループ間で最小二乗平均を比較し、Tukey 調整を使用して多重比較のために P 値を補正しました。サタースウェイト法を使用して自由度を推定しました。データは、本文および表では、平均値のプールされた標準誤差を伴う最小二乗平均値として示されています。有意性を示す確率レベルは P ≤ 0.05 で、0.05 < P < 0.10 は数値的傾向とみなされました。

この研究によって生成された生の配列決定データは、BioProject アクセッション番号 PRJNA878669 で NCBI Sequence Read Archive (SRA) に寄託されました。

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豚の研究にご協力いただいたティーガスク・ムーアパークの豚開発部門の農場スタッフに感謝します。これらの結果につながったプロジェクトは、アイルランドの欧州構造投資基金プログラム2014-2020の下、Enterprise Ireland（No. CF20150361）と欧州地域開発基金（ERDF）によって共同資金提供されました。 GEG と RR はまた、高等教育当局の新型コロナウイルス感染症対策費用延長を通じて資金提供を受けました。

エコイノベーション研究センター、理学部、ウォーターフォードキャンパス、サウスイースト工科大学、ウォーターフォード、アイルランド

ルース・ラティガン、ジェームズ・カレン、ジョン・P・フェラン、ジリアン・E・ガーディナー

豚開発部、動物および草地研究イノベーションセンター、ティーガスク、ムーアパーク、ファーモイ、コーク、アイルランド

ピーダー・G・ローラー、ダニエル・クレスポ＝ピアズエロ、サミール・ランジトカール

動物および草地研究およびイノベーションセンター、ティーガスク、グランジ、ダンセイニー、ミース州、アイルランド

ポール・コーミアン

APC マイクロバイオームアイルランド、ユニバーシティカレッジコーク、コーク、アイルランド

フィオナ・クリスピー

食品研究センター、ティーガスク、ムーアパーク、ファーモイ、コロラド州コーク、アイルランド

フィオナ・クリスピー

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GEG と PGL がこの研究を発案し、SR と協力して実験を設計しました。 PGL と GEG が研究を指揮しました。 SRとPGLは動物実験を実施した。 FC、JPP、および JC は実験室分析を実施しました。 RR は VFA データを統計的に分析しました。 PC はバイオインフォマティクス分析を実施し、微生物叢データを統計的に分析しました。 RR、PGL、DC-P.、PC、および GEG がデータを解釈しました。 RR、PGL、GEG が原稿を作成しました。 RR、PGL、GEG は原稿を改訂しました。著者全員が原稿の最終版を読んで承認しました。

ジリアン・E・ガーディナーへの通信。

ジリアン・ガーディナーとピーダー・ローラーは、「単離されたバチルス・アルティトゥディニス株とプロバイオティクスとしてのその使用」という特許を申請中である。他の著者は競合する利益を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Rattigan, R.、Lawlor, PG、Cormican, P. 他母親および/または離乳後にバチルス・アルティトゥディニス胞子を補給すると、ブタの初乳、消化物および糞便の微生物組成が調節されます。 Sci Rep 13、8900 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-33175-2

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受信日: 2022 年 8 月 17 日

受理日: 2023 年 4 月 8 日

公開日: 2023 年 6 月 1 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33175-2

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